PLA2 D49 and K49 mitoxins from the venom of Bothrops brazili snake : purification and structural and funcional characterization / Miotoxinas PLA 2 D49 e K49 do veneno total de Bothrops brazili : purificação e caracterização estruturação e funcional

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

As enzimas PLA2 provenientes de veneno de serpentes são intensamente estudadas devido a que os envenenamentos constituem um dos principais problemas de saúde em muitos paises. Por outro lado, estas toxinas ajudam a revelar aspectos desconhecidos da fisiologia celular e tisular. Neste trabalho, apresentamos a purificação e a caracterização bioquímica e farmacológica de duas miotoxinas fosfolipases A2: BbTX-II e BbTX-III, a partir de veneno de Bothrops brazili. As duas proteínas foram isoladas e purificadas usando um procedimento simples e rápido envolvendo duas etapas cromatográficas, exclusão molecular em Sephadex G-75 e HPLC de fase reversa (C18). A eletroforese de ambas miotoxinas mostrou massas relativas em torno de 13 e 27 kDa (para monômeros e dímeros respectivamente). Espectrometria de massa por MALDI-TOf confirmou a pureza das proteínas e mostrou que possuem massas moleculares em torno de 13,8 kDa. A análise de aminoácidos mostrou alto conteúdo de aminoácidos básicos e hidrofóbicos, assim como 14 resíduos de Cys. BbTX-III apresentou atividade PLA2 na presença de um substrato cromogênico, mostrando comportamento sigmoidal, principalmente à baixas concentrações. Atividade máxima foi alcançada em pH 8 e entre 35–45 oC. BbTX-III mostrou-se completamente dependente de Ca2+ e, na presença dos íons Mg2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+, a atividade enzimática foi reduzida a níveis similares aos observados na ausência de Ca2+. A análise de composição de aminoácidos mostrou alta presença de Lys, His e Arg (pI 8,46). A presença de 14 resíduos de cisteína sugere a formação de 7 pontes dissulfeto. O estudo de homologia da seqüência da PLA2 BbTX-III mostrou que existem posições extremamente conservadas nas PLA2. S(1), L(2), E(4) 7 a 10 (QMIL), Y(21). Os resíduos conservados Y(28), G(30), G(32), D(49), H(48) e Y(52) estão direta ou indiretamente ligados com a catálise. Além disso, BbTX-III apresentou algumas mutações: K(35) ->G(35), R(51) ->Y(51) e D(118) ->A(118) que estão estrategicamente posicionadas para a expressão da atividade catalítica. Apesar destas substituições, as atividades farmacológicas e a atividade catalítica são mantidas. O efeito neurotóxico de BbTX-III foi analisado in vitro na preparação neuromuscular biventer cervicis de pintainhos. O resultado mostrou que a toxina é menos potente quando comparada com venenos crotálicos. BbTX-III demonstrou efeito miotóxico local in vivo através da liberação de creatina quinase (CK) e, efeito inflamatório, através de edema de pata. Como a BbTX-III produziu forte efeito inflamatório, a hidrólise de fosfolipídios poderia ser relevante neste fenômeno. BbTX-II foi caracterizada como uma PLA2 K49 (cataliticamente inativa) em função das características físico-químicas evidenciadas: massa de 13,68 kDa, 121 resíduos de aminoácidos, caráter básico (pI 8.73) e alto grau de homologia seqüencial na sua estrutura primária, quando comparada com outras PLA2B K49 procedentes de veneno de serpentes botrópicas. O alinhamento com outras seqüências completas de PLA2 BK49 mostrou a presença de algumas mutações importantes. Assim, as substituições Y→N(27), N→P(58) e L→F(114) não modificaram os efeitos biológicos aqui estudados, revelando que poderiam estar relacionados com outras atividades. Os resíduos N(28), K(111), L(32) poderiam contribuir com a interrupção da catálise. Esta nova PLA2 K49 BbTX-II mostrou miotoxicidade local in vivo, atividade inflamatória e letalidade, corroborando que se enquadra dentro da família de proteínas PLAB2B K49. Os estudos de neurotoxicidade revelaram um efeito neurotóxico in vitro na preparação biventer cervicis de pintainho (20 µg/ml). BbTX-II e BbTX-III mostraram ser miotoxinas com atividade edematogênica e neurotóxica, independentemente de apresentarem atividade catalítica (BbTX-III) ou não (BbTX-II) Apoiando a existência de regiões moleculares distintas à catalítica responsáveis pelos efeitos farmacológicos. Os efeitos farmacológicos da toxina BbTX-III (PLA2B D49) provavelmente tenham uma estrita relação entre a atividade enzimática e a ligação da toxina com micro-domínios na membrana plasmática onde sua atividade seja maximizada e cause danos relevantes na organização da membrana. No caso da BbTX-II (PLAB2 K49) possivelmente a combinação de aminoácidos aromáticos/hidrofóbicos e positivamente carregados da região C-terminal seja a responsável de alterar a integridade da membrana plasmática.

ASSUNTO(S)

fosfolipase a2 phospholipases a2 bothrops brazili myotoxin edema bothrops brazili veneno - purificação venom miotoxina oedema

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