Otimização dinâmica do cultivo semi-contínuo de Pichia pastoris recombinante para produção das enzimas heterólogas alfa amilase e penicilina G acilase

AUTOR(ES)

Inti Doraci Cavalcanti Montaño

DATA DE PUBLICAÇÃO

2010

RESUMO

Este mestrado se propoe a estudar a otimizacao dinamica de biorreator automatizado, tipo tanque agitado e aerado, em escala de bancada (ate 5L), onde se processa o cultivo semi-continuo de Pichia pastoris recombinante. Essa levedura foi clonada pelo grupo do prof. Fernando Torres, da UnB, utilizando o promotor PGK1, que dispensa a utilizacao de metanol como indutor, expressando constitutivamente a enzima -amilase de Bacillus subtilis. Durante a execucao deste mestrado, a enzima penicilina G acilase (PGA) de Bacillus megaterium esta sendo clonada pelo grupo de biologia molecular do DEQ-UFSCar usando a mesma construcao e, portanto, a cinetica de crescimento e producao da PGA heterologa devera ser muito semelhante as da -amilase, utilizada como estudo de caso para otimizacao do bioprocesso. Cultivos de Pichia pastoris recombinante foram realizados em frascos agitados, utilizando meio de cultivo padrao, objetivando o levantamento de dados cineticos, ponto de partida para o escalonamento em biorreator de bancada. Posteriormente, foram realizados ensaios em biorreator de 5L, em batelada e batelada alimentada. Com os dados obtidos nos cultivos em biorreator, e utilizando algoritmo hibrido para estimativa de parametros (que combina o metodo global Simulated Annealing, com o local de Levenberg-Marquardt), implementado em MatLab e disponivel no LaDABio (Laboratorio de Desenvolvimento e Automacao de Bioprocessos), foram ajustados parametros cineticos de crescimento, para serem utilizados nas simulacoes dos cultivos em biorreator. A partir dai, foi desenvolvido modelo de crescimento microbiano e de producao, utilizando um enfoque classico (modelo nao-estruturado, nao-segregado) para descrever o sistema. Com isso, torna-se possivel realizar simulacoes em computador usando diferentes estrategias de alimentacao, para mapear a dinamica do sistema. A seguir, foram desenvolvidos algoritmos de controle otimo em malha aberta para definicao de estrategias de alimentacao. Concentracoes celulares de 5,4 g/L (massa seca) foram alcancadas em cultivos em camara rotatoria (20h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 218 U/mL de -amilase, comparado com 11,4 g/L(massa seca) que foram atingidos em cultivos em biorreator em bateladas simples (10h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 156 U/mL de -amilase. Em cultivos em batelada alimentada concentracoes celulares de ate 45 g/L foram atingidas, expressando ate 260 U/mL de -amilase, com uma produtividade de 5,2 U/mL/h. Em cultivo em batelada alimentada de P. pastoris expressando PGA, concentracoes celulares de ate 35 g/L foram atingidas. Nao foi detectada atividade enzimatica no caldo de cultivo devido ao efeito da glicosilacao. Reacao de imunodeteccao confirmou a expressao da enzima recombinante. Foram ajustadas quatro equacoes de velocidade especifica de crescimento, com diferentes tipos de inibicao por um produto, detectado em niveis importantes por cromatografia liquida de alto desempenho, mas ainda nao identificado. Esse metabolito foi inserido como inibidor nos modelos cineticos, utilizando as areas dos picos, normalizadas, como uma pseudoconcentracao. Os melhores ajustes aos dados experimentais foram com modelo cinetico de Monod com inibicao nao-competitiva. Valores tipicos obtidos para a velocidade especifica maxima de crescimento e de fator de conversao glicose/celula em biorreator foram max = 0,24 h-1 e YX/S = 0,48. Algoritmo de controle otimo em malha aberta foi desenvolvido e implementado com sucesso, prevendo de forma robusta perfis otimos de alimentacao, cuja validacao fica proposta como continuidade deste trabalho.

ASSUNTO(S)

controle ótimo kinetics of cultivation engenharia quimica constitutive expression pichia pastoris penicilina g acilase (pga) penicillin g acylase (pga) expressão constitutiva alpha- amylase recombinant pichia pastoris enzimas recombinantes optimal control engenharia bioquímica cinética do cultivo alfa-amilase

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