Morfogênese in vitro em tomateiro e berinjela e silenciamento gênico da sintase do mio-inositol-fosfato por RNAi em tomateiro / In vitro morphogenesis in eggplant and tomato plants and silencing of myo-inositolfosfate sintase gene by RNAi in tomato plants

Denise Fernandes

Este trabalho teve como objetivo: i) a otimização das condições de desinfestação de seentes de tomateiros (Solanum lycopersicum Mill.) e berinjela (Solanum melongena L.); ii) a avaliação da influência do tipo de vedação sobre a qualidade das plântulas e explantes oriundos destas; iii) a avaliação do efeito da sonicação sobre a morfogênese in vitro de explantes de tomateiros e sobre a viabilidade de células de Agrobacterium tumefaciens; iv) o estabelecimento de parâmetros para possibilitar a transformação genética mediada por A. tumefaciens visando ao silenciamento gênico mediado por RNAi da sintase do mio-inositol-fosfato, utilizando-se o gene GmMIPS1. Na desinfestação das sementes de berinjela, comprovou-se que tratamentos utilizando imersão em água deionizada são mais eficientes que imersão em solução de 0,13% v/v de cloro. A utilização de desinfestação a seco, em câmara de gás cloro, não é indicada para a assepsia de sementes de tomate e berinjela, pela toxicidade do gás às sementes, comprometendo sua germinação. Observou-se que as trocas gasosas favorecem o desenvolvimento das plântulas e geram explantes em maior número e de melhor qualidade para utilização de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Ao se utilizar a técnica de SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation), os explantes e a suspensão bacteriana foram expostos a tempos de exposição ao ultra-som (0, 3, 6 e 9 segundos). Verificou-se que o intervalo de 3 a 6 segundos é o indicado para se utilizar em transformação genética, pois resultou nas maiores áreas de expressão transiente avaliada pela análise histoquímica in situ do gene GUS, maior número de estruturas regeneradas e menor mortalidade nas células de A. tumefaciens. O processo foi otimizado quando a imersão em suspensão de A. tumefaciens foi realizado após 24 horas de exposição ao ultra-som. Para ser possível a seleção de transformantes foi estabelecida a curva de letalidade ao agente higromicina e a concentração encontrada para seleção de células não transformadas foi de 7,5 mg.L-1 em explantes cotiledonares, hipocotiledonares e foliares de tomateiro. Dosagens acima de 7,5 mg.L-1 mostratam-se tóxicas, resultando em explantes com áreas cloróticas e necróticas. A fim de verificar a relação do gene MIPS com o desenvolvimento de sementes, a transformação genética foi realizada com sucesso em tomateiro e berinjela, via A. tumefaciens contendo plasmídeo com construção de silenciamento por siRNA para o gene MIPS, utilizando uma seqüência conservada do gene de soja GmMIPS. A natureza transgênica dos regenerantes primários foi confirmada mediante o teste histoquímico in situ de GUS e análise de PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. A análise de expresão gênica confirmou o silenciamento do gene MIPS, e a análise morfológica dos frutos confirmou a hipótese do relacionamento da mio-inositol-fosfato-sintase com o desenvolvimento de sementes. Porém, conforme detectado pela técnica de citometria de fluxo, o processo de regeneração in vitro adotado no protocolo de transformação de tomateiro, ao contrário de berinjela, induziu poliploidia em algumas plantas transgênicas.

Morfogênese in vitro em tomateiro e berinjela e silenciamento gênico da sintase do mio-inositol-fosfato por RNAi em tomateiro / In vitro morphogenesis in eggplant and tomato plants and silencing of myo-inositolfosfate sintase gene by RNAi in tomato plants

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