Clonagem, expressão heteróloga, purificação e caracterização funcional da endoglicanase A de Aspergillus nidulans

AUTOR(ES)

Eveline Queiroz de Pinho Tavares

DATA DE PUBLICAÇÃO

2010

RESUMO

O Bioetanol é um combustível alternativo particularmente interessante, pois paralelamente às técnicas já estabelecidas pela indústria sucroalcooleira no Brasil, são geradas imensas quantidades de bagaço-de-cana, um resíduo bastante sub-aproveitado. Este pode apresentar de 40 a 50% de celulose, polímero resultante da repetição de unidades de Dglicose unidas por ligações ß-1,4. Estas podem ser alvo de enzimas celulolíticas produzidas principalmente por fungos filamentosos. O emprego de estratégias envolvendo sistemas heterólogos para produção destas enzimas pode favorecer o alcance dos níveis máximos de produção em prazos inferiores aos observados em sistemas nativos, além de facilitar a purificação da proteína recombinante. Neste trabalho, foi realizada a caracterização parcial da endoglicanase A (EG A) de Aspergillus nidulans, enzima de interesse biotecnológico incluída no projeto da rede Bioetanol (MCT/FINEP), onde nosso grupo desenvolve a meta de Produção de celulases recombinantes em sistema heterólogo de Pichia pastoris. As construções para clonagem envolveram promotores induzíveis por metanol, sendo o vetor de expressão obtido dirigido para integração no genoma de P. pastoris. Assim, após clonagem e transformação desta levedura metilotrófica, foi realizada a expressão heteróloga desta enzima seguida de sua purificação parcial. Empregando o sobrenadante dos clones recombinantes, foi obtido um produto heterólogo com atividade máxima em carboximetilcelulose (CMC) a partir de 24 h de indução. Após purificação empregando ultrafiltração e filtração em gel, a enzima recombinante foi caracterizada, atuando preferencialmente em pH ácido (de 4,5 a 5,0) e temperatura próxima a 50oC, em torno da qual esta enzima apresentou-se termoestável a 45 e 55oC por cerca de 48 h. Foi observado um incremento de 30 a 80% nos valores de atividade diante da incubação com Co2+, DTT e ß-mercaptoetanol. A degradação de substratos alternativos mostrou-se significativa somente na incubação com CMC e, em menor extensão, em papel de filtro. Além disso, a análise de atividade em gel e o perfil eletroforético das amostras das etapas da purificação confirmaram a massa molecular de 34 kDa, conforme esperado.

ASSUNTO(S)

bioethanol aspergillus nidulans bioetanol endoglucanase endoglicanase biologia molecular aspergillus nidulans pichia pastoris heterologous expression expressão heteróloga em pichia pastoris

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