Expressão heterológa, purificação e caracterização estrutural do peptídeo (171-194) da p24 do HIV-1.

AUTOR(ES)

Priscila Vasques Castilho

DATA DE PUBLICAÇÃO

2004

RESUMO

As proteínas do centro do HIV-1 estão envolvidas em processos cruciais durante o ciclo de vida viral. A p24 é a principal proteína do capsídeo do HIV e é inicialmente expressa como parte da poliproteína Gag. A associação das proteínas Gag na superfície da membrana interna da célula hospedeira dá início à montagem viral e desencadeia o processo de brotamento da membrana da célula hospedeira. Dessa forma, a p24 possui um importante papel estrutural tanto no contexto da Gag, como na sua forma madura. Nesse sentido, foi escolhido um peptídeo da região C-terminal da p24, TLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNA, (p24-3) que compõe a região principal responsável pela dimerização da proteína p24. O peptídeo linear, rp24-3, e sua variante cíclica, rp24-3m, foram produzidos em Escherichia coli via estratégia recombinante. Os fragmentos gênicos foram obtidos por meio da montagem de genes sintéticos e foram inseridos no vetor pET 32a para a produção como proteínas de fusão na forma solúvel. Os produtos expressos foram purificados por cromatografia de afinidade em Ni e submetidos a uma clivagem enzimática. Os peptídeos foram então purificados por cromatografia em fase reversa e suas sequências primárias e massas moleculares foram inferidas por meio do sequenciamento de aminoácidos e análises por espectrometria de massa, respectivamente. A estrutura secundária do rp24-3 foi investigada por dicroísmo circular e fluorescência estática, mostrando-se estruturado diferentemente em água e em PBS. Além disso, o triptofano está em um ambiente parcialmente escondido. A adição de metanol acima de 70% causou um grande aumento no conteúdo de hélices. Concluíndo, este trabalho mostra um sistema viável para a produção do rp24-3, proporcionando quantidades necessárias para a realização de estudos estruturais.

ASSUNTO(S)

genetica hiv-1 peptídeo p24 genética molecular expressão heteróloga

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