Aperfeiçoamento da metodologia para contagem de Bacillus sporothermodurans e sua ocorrencia em leite UAT/UHT

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2000

RESUMO

Nos últimos anos, em nível internacional, o microrganismo Bacillus sporothermodurans (BSP) vem sendo isolado a partir de leite processado pelo sistema UAT/UHT (Ultra Alta TemperaturalUltra High Temperature). Também no Brasil, mais recentemente, o microrganismo foi isolado a partir de amostras de leite UAT produzido em unidades industriais do Estado de São Paulo e Paraná. As amostras contaminadas apresentaram contagens em torno de 105UFC/ml sem evidências maiores de alterações organolépticas. No entanto, nestas condições, o leite UAT fica fora dos padrões exigidos pela legislação para o produto quanto a contagem de microrganismos aeróbios mesófilos, que é de 102UFC/ml(portaria SVSIMS n12451/97). Na primeira parte desta pesquisa, procurou-se avaliar e otimizar a metodologia para detecção de BSP, usando-se como referência a cepa DSMZ 10599, da Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares (Deutsche Sammlug von Mikroorganismen und Zellkulturen). Em uma primeira etapa, avaliou-se qualitativa e quantitativamente o desempenho do ágar Infusão de Cérebro e Coração (BHI), ágar Padrão de Contagem (PCA) e o ágar Nutriente (NA) na contagem de BSP. Além disso, comparou-se as técnicas de inoculação em profundidade (pour p/ate) e espalhamento superficial (spread plate). Os melhores resultados foram obtidos pelo uso do ágar BHI (colônias mais diferenciadas e com melhor crescimento) e o uso da técnica de espalhamento superficial (maior uniformidade e crescimento das colônias). Numa segunda etapa formulou-se o meio diferencial (ágar BHI-E), com base na adição de 1g/I de esculina e 0,5gl1 de citrato férrico amoniacal, permitindo, assim, a melhor caracterização das colônias de BSP pelo seu enegrecimento e formação de halo escuro pela hidrólise da esculina. Numa terceira etapa, comprovou-se que a adição destes componentes não ocasionou quaisquer efeitos inibitórios comparativamente ao ágar BHI. Finalmente, numa última etapa, avaliou-se a eficiência da ágar BHI-E na diferenciação de BSP frente a outros Bacillus spp de ocorrência comum em produtos lácteos, caso de Bacillus cereus, Bacillus subtilis e Bacillus firmus. Na segunda parte da pesquisa, analisaram-se 100 amostras de leite UAT de 3 regiões do Brasil (Centro-Oeste, Sudeste e Sul) utilizando o ágar BHI-E desenvolvido na primeira fase. Verificou-se que 45% das amostras estavam fora dos padrões da Portaria SVS/MS no 451/97 e que 55% delas apresentavam esporos mesófilos termo-resistentes. Isolaram-se 300 colônias que hidrolisaram esculina e tinham aspecto semelhante às colônias do Bacillus sporothermodurans em ágar BHI-E. A maior parte dos isolados apresentou morfologia típica e produzia oxidase, sendo que poucos não fermentaram a glicose. Vinte e quatro cepas, da segunda etapa da pesquisa, tiveram o seu DNA cromossômico avaliado pelo método RAPD ("random amplified polymorphic DNA"). Os perfis de DNA obtidos permitiram dividí-Ias em 3 grupos que apresentaram perfiJde DNA muito semelhantes ao do BSP Abstrat: Bacillus sporothermodurans - BSP - has been isolated worldwide in milk processed by the ultra high temperature system (UHT-milk). More recently BSP has also been isolated in Brazil, partieularly in industrial samples processed in São Paulo and Paraná states. Ali the samples showed total counts around 105cfu/ml without any organoleptie ehanges. However based on Brazilian microbiological standards (Portaria SVS/MS nQ451/97) fixing a limit of 1&cfu/ml, the samples were eonsidered inadequate, being rejected. The objective of the first part of this research was the evaluation and improvement of the methodology for Bsp detection, employing as reference the strain DSMZ 10599 from Germany Colection of Microorganisms and Cells Cultures (Deutsche Sammlug von Mikroorganismen und Zellkulturen). In a first step, the performanee of Brain Heart Infusion agar (BHI agar), Total Plate Count Agar (PCA) e Nutrient agar (NA) were comparatively evaluated, considering tooa the inoculation methods (pour plate compared to spread plate). The results showed the best performance of BHI agar with more uniform and better growth of Bsp, the same being valid eoncerning the use of spread plate compared to the pour plate method. In a seeond step, it was formulated a differential medium named BHI-E agar, based on addition of 19/1 of esculin and 0,5gl1 of ferrie ammonium eitrate; with this modification, BSP showed typical black colonies with a black halo due to esculin hydrolisis. In a third step, it was concluded that BHI-E agar did not show any inhibitory effect when compared to BHI agar. Finally, in a last step, BHI-E agar was evaluated in relation to the other Bacillus spp commonly found em milk products, particularly Bacillus cereus, Bacillus subtilis and Bacillus firmus. In the second part of the research work, a total of 100 comercial samples of UHT milk produced in 3 different Brazilian regions (Center-east, southern and southeast) were analysed using BHI-E agar previously developed and tested. The results showed that 45% of the examined samples did not attend the Brazilian standards (Portarja SVS/MS nQ451197)and 55% were contamined with mesophilic thermoresistant bacterial species. A total of 300 esculin positive cultures were isolated with morphological and cultural aspects similar to BSP besides being oxidase positive but generally showing a slow glucose fermenting activity. Twenty four strains isolated at the second part of this research were sub-tiped by molecular typing (RAPO). These 24 strains could be separated in 2 groups according to their ONA pattern. The profiles of 3 groups were very similar to that ONA pattern of Bacillus sporothermodurans (BSP)

ASSUNTO(S)

leite bacillus (bacteria) reação em cadeia de polimerase cultura e meios de cultura (biologia)

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