SeleÃÃo e caracterizaÃÃo de peptÃdeos recombinantes mimÃticos de antÃgenos do vÃrus da dengue por "PHAGE DISPLAY"

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

RESUMO - GERAL A dengue à uma doenÃa infecciosa febril aguda, transmitida de uma pessoa doente a uma pessoa sadia pela picada da fÃmea contaminada de um mosquito Aedes aegypti. A doenÃa à causada por um arbovÃrus, membro da famÃlia Flaviviridae e do gÃnero flavivirus. Existem quatro tipos de vÃrus da dengue: Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 e Dengue 4, e hà um grande espectro de manifestaÃÃes clÃnicas da doenÃa, sendo as duas principais, a dengue clÃssica e a dengue hemorrÃgica. O diagnÃstico geralmente à baseado em sintomas, e laboratorialmente à tardio, no entanto vÃrios testes especÃficos para cada sorotipo. A tecnologia do âPhage Displayâ (exposiÃÃo de biomolÃculas em fagos) tem sido amplamente utilizada no mapeamento de epÃtopos de diversos antÃgenos, constituintes de vÃrios agentes causadores de doenÃas. Com o objetivo de selecionar peptÃdeos recombinantes expressos no capsÃdeo de bacteriÃfagos produziu-se soro policlonal em galinhas previamente sensibilizadas com proteÃnas totais do vÃrus da dengue tipo 3. ApÃs 4 ciclos de seleÃÃo de uma biblioteca de fagos com peptÃdeos recombinantes lineares de 7 resÃduos contra a IgY policlonal, 14 fagos imunorreativos foram selecionados e suas seqÃÃncias de Ãcidos nuclÃicos foram posteriormente analisadas por bioinformÃtica. Foi possÃvel identificar domÃnios protÃicos comuns entre os peptÃdeos, sendo que o principal domÃnio mapeado foi VLRN. Testes subseqÃentes se fazem necessÃrios para a melhor caracterizaÃÃo destes peptÃdeos, incluindo possÃveis aplicaÃÃes diagnÃsticas e vacinais dos peptÃdeos selecionados. RESUMO - CAPÃTULO I A dengue à causada por um arbovÃrus da famÃlia Flaviridae, transmitido de uma pessoa à outra atravÃs de um hospedeiro intermediÃrio, o mosquito Aedes aegypti. à uma doenÃa infecciosa tropical e subtropical caracterizada por febre e dor intensa nas articulaÃÃes, alÃm de sangramentos intensos quando na sua forma hemorrÃgica. Neste trabalho utilizou-se da tecnologia de exposiÃÃo de peptÃdeos randÃmicos em fagos, phage display, no intuito de identificar peptÃdeos recombinantes com afinidade a anticorpos policlonais (IgY) gerados em galinhas imunizadas com proteÃnas totais do vÃrus da dengue tipo 3. As IgYs dos animais foram purificadas em coluna HiTrap e concentradas por diÃlise. As IgYs foram imunorreativas contra todas as culturas de DENV, mas nÃo foram tipo especÃfico. Os clones foram selecionados de uma biblioteca de fagos randÃmicos (PhD-7) por quatro ciclos de seleÃÃo contra as IgYs. Os fagos selecionados foram amplificados em placas deepwell e submetidos a testes ELISA. Clones imunorreativos contra IgY foram seqÃenciados, traduzidos e analisados por bioinformÃtica. Quatorze clones distintos foram selecionados e alinhados contra a seqÃÃncia de dados do proteoma viral e entre todos eles. TrÃs seqÃÃncias consenso entre os clones foram detectadas: VLRN, APP e LPP. A procura por provÃveis seqÃÃncias protÃicas do vÃrus da dengue no BLAST mostrou similaridade a diversos sÃtios protÃicos virais: poliproteÃna, envelope e as proteÃnas nÃo-estruturais NS1, NS2a, NS3 e NS5. Todas elas se alinharam com as seqÃÃncias dos tipos DENV-1, -2, -3, e/ou -4, corroborando com a falta de especificidade das IgYs. Considerando o motivo VLRN, as anÃlises dos Ãndices de antigenicidade dos peptÃdeos similares demonstraram que estes Ãndices sÃo altamente influenciados pelos resÃduos vizinhos. AnÃlise 3-D da proteÃna do capsÃdeo viral do tipo DENV-2, com superposiÃÃo do motivo VLRN, identificou duas seqÃÃncias alvos, NRVSTVQQL e EIGRMLNILNRR, que estavam presentes na poliproteÃna dos quatro tipos virais, os quais podem conter dois provÃveis domÃnios, VxRN e LRN, respectivamente. DomÃnios de fosforilaÃÃo e glicosilaÃÃo, encontrados em vÃrus eucariÃticos, foram similares Ãs seqÃÃncias presentes em cinco fagos recombinantes selecionados, o que nÃo implica que estes motivos sejam fisiologicamente ativos no vÃrus da dengue. Finalmente, os peptÃdeos foram usados para detectar IgG e IgM humana. Testes ELISA foram realizados em dois pacientes com infecÃÃes isoladas de DENV-1 ou DENV-3. A reatividade dos 14 clones foi superior Ãquela observada para antÃgenos totais obtidos das culturas, embora nÃo tenha sido especÃfica.

ASSUNTO(S)

phage display dengue genetica anticorpo monoclonal

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