Purificação e caracterização da fosfatase acida de rim bovino

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2004

RESUMO

A fosfatase ácida de BPM do rim bovino foi purificada 1.640 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 7%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, tratamento ácido e cromatografia de trocaiônica em SP-Sephadex com eluição por íon-afinidade. Os critérios de pureza utilizados foram a A.E., PAGE, SDS-PAGE, filtração em gel (Superdex HR 70) e análise da composição de aminoácidos. A enzima purificada (A.E. de 100 µmol min-1 mg-1) é composta por uma cadeia polipeptídica simples e possui Mr de 13,6 e 17,8 kDa, como determinado através da filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente. A composição parcial de aminoácidos (Cys e Trp não foram determinados) foi obtida após a hidrólise ácida da proteína purificada seguida da análise dos resíduos de aminoácidos e evidenciou a existência de, pelo menos, 152 resíduos de aminoácidos. O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou uma faixa de pH ótimo de 4,5 a 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 60°C e, nesta temperatura, maior estabilidade no pH 5,5. A atividade da enzima foi relativamente pouco sensível a diversos compostos, reagentes redutores de tióis e íons metálicos, exceto pela inibição por Zn2+ e Cu2+ e pela ativação por guanosina. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto e inibição por vanadato (Ki, 0,465 µM), piridoxal-5-fosfato (Ki, 2,18 µM), fosfato inorgânico (Ki, 0,769 mM), pCMB e molibdato de amônio. A energia de ativação para a hidrólise do p-NPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 43,31 kJ.mol-1. A análise da capacidade da enzima catalisar a reação de transfosforilação demonstrou que diversos álcoois atuaram como aceptores de fosfato neste tipo de reação, tendo se destacado o glicerol e o metanol como os melhores aceptores. Dos substratos testados, o p-NPP, ?-Naftil-P, a FMN e a Tyr-P foram os únicos hidrolisados significativamente com KM de 0,14; 0,4; 0,3 e 7,9 mM, respectivamente. A faixa de pH ótimo para a hidrólise da Tyr-P e FMN foi de 5,0 a 5,5

ASSUNTO(S)

rins bovino fosfatases

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