PCR em tempo real para detecção e quantificação de Aspergillus Westerdijkiae em grãos de café

AUTOR(ES)

Luis Gustavo Morello

DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

Ocratoxina A (OA) é uma micotoxina encontrada tanto em grãos de café como na bebida preparada a partir de grãos contaminados. O perfil toxicológico desta micotoxina inclui carcinogenicidade, nefrotoxicidade e imunotoxicidade. O café é uma bebida extensivamente consumida no mundo e o Brasil se configura como o maior produtor de grãos de café do mundo. Apesar do café não ser a principal fonte de OA no consumo humano, ações para evitar a presença deste metabólito em grãos de café são necessárias para diminuir a exposição humana a esta micotoxina. OA foi descoberta em 1965, como um metabólito secundário de A. ochraceus, mas após isso, várias outras espécies de Aspergillus e Penicillium foram descritas como produtoras de OA. Atualmente, Aspergillus westerdijkiae é reconhecido como a mais importante espécie produtora de OA em grãos de café. Aspergillus westerdijkiae é uma nova espécie de fungo que foi recentemente desmembrada a partir do taxon Aspergillus ochraceus. Essa espécie é muito similar a A. ochraceus e vários isolados previamente identificados como A. ochraceus, agora são identificados como A. westerdijkiae. De acordo com a literatura, isolados de A. westerdijkiae são muito freqüentes e a maioria deles é capaz de produzir grandes quantidades de OA. Neste trabalho, vários isolados obtidos de amostras de grãos de café brasileiro, previamente identificados como A. ochraceus foram comparados com aquelas de A. westerdijkiae através das seqüências de nucleotídeos que codifica para a ß-tubulina. De fato, a maioria (84%) foi reconhecida como pertencente à espécie A. westerdijkiae. Devido ao fato que isolados de A. westerdijkiae freqüentemente produzem grandes quantidade de OA, desenvolveu-se um par de primers específico para detectar e quantificar esta espécie em grãos de café utilizando-se da técnica de PCR em tempo real. O par de primers desenhado (Bt2Aw-F 5 TGATACCTTGGCGCTTGTGACG / Bt2Aw-R 5 CGGAAGCCTAAAAAATGAAGAG) permitiu a obtenção de um amplicon de 347 pb em todos os isolados de A. westerdijkiae e nenhuma reação cruzada foi observada usando DNA de A. ochraceus. A especificidade deste par de primers para amplificar A. westerdijkiae motivou a investigação da possibilidade de seu uso para quantificar A. westerdijkiae em grãos de café. Após inoculação e incubação de grãos de café, extrações de DNA e ensaios de cfu foram realizadas em intervalos de 48 h. Embora uma x correspondência entre o número de genomas haplóides e cfu tenha sido observada, a estimativa dos números de cópia de genoma foi sempre maior do que os números de cfu. Utilizando diluições seriadas (10-1 a 10-9) do DNA extraído de grãos de café infectados, e incubados por 48 h, detectou-se um sinal positivo até a diluição de 10-5, o que significa mais de 1 e menos de 10 cópias de genoma haplóide de A. westerdijkiae. Este valor também significa menos de 10 genomas haplóides por 0,1 grama de grãos de café. O nível de sensibilidade do PCR em tempo real foi 100 vezes maior do que a técnica de cfu. Palavras-chaves: Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus ochraceus, ocratoxina A, PCR em tempo real.

ASSUNTO(S)

reação em cadeia de polimerase polymerase chain reaction food - microbiology aspergillus alimentos - microbiologia aspergilos

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