Mycobacterium bovis BCG expression vectors using auxotrophic complementation as selectable marker / Vetores de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando complementação auxotrófica como marcador seletivo

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2004

RESUMO

Um novo sistema de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando complementação auxotrófica como marcador de seleção foi desenvolvido. Para testar esse sistema, o gene leuD foi clonado no vetor pUS977 e sua capacidade seletiva for avaliada por transformação das cepas de M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144 auxotróficas para o aminoácido leucina. A remoção do gene de resistência ao antibiótico canamicina foi realizada pelo sistema de recombinação homóloga sítioespecifica Cre-lox do Bacteriófago P1 e por digestão com a enzima de restrição HindIII e posterior religação com T4 DNA ligase. A avaliação da estabilidade dos novos vetores foi realizada por cultivo bacteriano em meio seletivo (sem leucina) e em meio nãoseletivo por mais de 190 gerações. A seleção por complementação de BCG auxotrófica se mostrou equivalente à seleção por resistência a antibiótico. O gene da canamicina foi removido por ambos os sistemas, mas a remoção por digestão com HindIII foi mais eficaz, com 95% e 85% de remoção em M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144, respectivamente. M. bovis BCG ∆leuD transformado com pUS977leuD e cultivado em meio seletivo (sem suplementação de leucina) se manteve estável após 7 subcultivos. Quando M. smegmatis mc2144/pUS977leuD foi cultivada em meio seletivo, 100% das unidades formadoras de colônias mantiveram o vetor mesmo após 20 subcultivos. Os resultados obtidos demonstram que este é um sistema de seleção eficaz e que e pode ser utilizado para a expressão de antígenos heterólogos em BCG permitindo a manutenção da pressão seletiva in vivo sem uso de resistência a antibiótico.

ASSUNTO(S)

biotecnologia biologia molecular complementação auxotrófica vacinas vetores mycobacterium bovis bcg

ACESSO AO ARTIGO

Documentos Relacionados