INFLUENCE OF THE HOST (CHO) AND OF THE CULTIVATION STRATEGY ON GLYCAN STRUCTURES AND MOLECULAR PROPERTIES OF HUMAN THYROTROPHIN / Influência do hospedeiro (CHO) e da estratégia de cultivo nas estruturas glicídicas e propriedades moleculares da tireotrofina humana

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

Neste trabalho foi desenvolvida pela primeira vez uma estratégia de purificação com duas etapas, uma cromatografia de troca iônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência em fase-reversa (RP-HPLC), para obter um hTSH derivado de CHO (r-hTSH-IPEN), que mostrou-se rápida e prática, permitindo um rendimento de 70% e uma pureza >99%. Um aumento de ~60% na produtividade de r-hTSH-IPEN foi observado quando condições de cultura celular foram alteradas de 5% de CO2 para ar (0,03% CO2). A qualidade dos produtos obtidos em ambas as condições foi avaliada com relação à estrutura dos N-glicanos, aos isômeros de carga e à atividade biológica em comparação com a única preparação comercial conhecida (Thyrogen®) e com uma preparação de referência de origem hipofisária (p-hTSH) do National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, EUA). Os N-glicanos identificados nas preparações recombinantes foram do tipo complexo, apresentando estruturas bi-, tri- e tetra- antenárias, algumas fucosiladas, sendo 86-88% sialiladas com níveis variáveis. As três estruturas mais abundantes foram monosialiladas, representando ~69% de todas as formas identificadas nas três preparações. A principal diferença foi encontrada em termos de antenaridade, com 8-10% mais estruturas bi-antenárias na ausência de CO2 e 7-9% mais estruturas tri-antenárias na presença de CO2. No caso do p-hTSH foram identificadas estruturas do tipo complexo, com alta-manose e híbridas, a maioria delas contendo resíduos terminais de ácido siálico e/ou sulfato. As duas estruturas mais abundantes contem um ou dois resíduos de sulfato, sendo que no primeiro caso ele inesperadamente se liga a uma galactose. A porcentagem de ligação do ácido siálico à galactose nas conformações 2-3 e 2-6 foi de 68 ± 10% e 32 ± 10% respectivamente. Não foram observadas diferenças fundamentais nos isômeros de carga, nas três preparações recombinantes, os perfis da focalização isoelétrica mostrando seis bandas distintas no intervalo de pI de 5,39 a 7,35. Uma distribuição consideravelmente diferente, com várias formas na região ácida, foi observada, no entanto, para duas preparações hipofisárias. Uma bioatividade ligeiramente superior (p <0,02) foi encontrada para o r-hTSH-IPEN obtido na presença de CO2 quando as preparações foram analisadas com boa precisão por um simples bioensaio em dose única; esta atividade, no entanto, não é significativamente diferente da atividade do Thyrogen, as duas preparações sendo 1,6 e 1,8 vezes mais potentes do que a preparação de referência (p-hTSH). Podemos concluir que, pelo menos para o caso dos r-hTSH derivados de CHO, diferentes condições de cultivo não afetam significativamente as estruturas dos N-glicanos, distribuição de isómeros de carga ou atividade biológica. Thyrogen e r-hTSH-IPEN, quando comparados com p-hTSH-NIDDK, apresentaram cerca de 7% de aumento da massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS. Esta técnica, que permite uma avaliação exata da massa do heterodímero, apresentou valores de MR de 29611, 29839 e 27829, respectivamente. Diferenças significativas foram encontradas entre o r-hTSH e o p-hTSH pelo que se refere às propriedades hidrofóbicas, avaliadas por RP-HPLC. Também foram observadas diferenças relacionadas à composição de carboidratos, principalmente de ácido siálico e galactose, tendo sido encontrado um menor teor destes resíduos no p-hTSH.

ASSUNTO(S)

estrutura de n-glicanos bioensaio in vivo tirotrofina (tsh) focalização isoelétrica tirotrofina (tsh) cultura celular focalização isoelétrica bioensaio in vivo cultura celular estrutura de n-glicanos

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