Identificação de diferentes modos de ligação do domínio N-terminal da angiotensina II com receptores AT, selvagem e mutantes. / Identification of different binding modes of N-terminal end of angiotensin II with wild type and mutant AT1 recptors.

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

26/08/2009

RESUMO

Martin, Renan Paulo. Identificação de diferentes modos de ligação do domínio N-terminal da angiotensina II com receptores AT, selvagem e mutantes. [Identification of different binding modes of N-terminal end of angiotensin II with wild type and mutant AT1 recptors]. Orientadora: Suma Imura Shimuta. São Paulo: s.n, 2009. [113]. Dissertação(Mestrado em Ciências)-Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Recebida em janeiro/2010. Resumo: Objetivos: Determinar os níveis de expressão dos receptores AT1 endógeno e exógeno nas células da musculatura lisa vascular de coelho transfectadas com o cDNA do receptor AT1 de rato para investigar uma correlação com o fenômeno de taquifilaxia induzida pela [Lys2 ]-AngII nessa linhagem de células; Investigar as propriedades de ligação do receptor AT1 com mutação da Cys18 por Ser, aos agonistas AngII, [Sar 1 ]- AngII e [Lys2 ]-AngII; Investigar a possível causa da predominância intracelular do receptor mutado C18S, utilizando antagonistas para reversão da internalização constitutiva e teste de maturação do receptor com calnexina. Métodos: Foi utilizado PCR em tempo real para determinar a expressão dos receptores AT1 endógeno e exógeno nas duas linhagens estudadas; a avaliação das propriedades de ligação do receptor mutante C18S foi baseada em ensaios de competição com radioligantes 3 H- AngII ou 125 I-AngII, utilizando os agonistas AngII, [Sar 1 ]-AngII e [Lys2 ]-AngII como ligantes frios, não marcados; para testar a hipótese de internalização constitutiva, células expressando o mutante ou o receptor selvagem foram tratadas com antagonistas do receptor AT1 e em seguida determinado-se os níveis de IP3 formado e alterações nas concentrações intracelulares de Ca2+ em condições de repouso e em resposta a concentrações crescentes de AngII e [Sar 1 ]-AngII. Para avaliar a hipótese da falta de maturação, foi realizada a imuno-marcação da calnexina, uma chaperona molecular envolvida na correta maturação de proteínas. Esta em seguida foi examinada para a sua co-localização com o receptor AT1 selvagem ou mutante, ambos marcados com GFP. Resultados e conclusões: Foi possível verificar que a mudança no comportamento das células que expressam o receptor exógeno, tornando-se taquifiláticas à [Lys2]-Angii enquanto a linhagem só expressando o receptor endógeno era taquifilática especificamente para a Angii, foi devido ao fato que o receptor exógeno foi cerca de 200.000 vezes mais expresso que o endógeno. Essa superexpressão pode ser atribuída à ubiquitina, vetor usado na expressão do receptor AT1 exógeno. Na segunda abordagem do trabalho, verificou-se que houve alterações nas propriedades de ligação do receptor mutado C18S. Esse mutante com a quebra da ponte S-S (Cys18 e Cys274) apresentou maior afinidade à [SAR 1]-AngII do que à AngII enquanto ocorreu completo impedimento na sua ligação à [Lys2 ]-AngII. Esses resultados foram observados quando a 3 H-AngII foi utilizada como traçador radioativo. Por outro lado, quando 125 I-AngII foi empregada, a ligação desse radioligante foi drasticamente inibida, impedindo assim a determinação dos parâmetros de ligação da AngII e dos análogos com o receptor mutado. Os resultados obtidos com a 3 H-AngII sugeriram que a quebra da segunda ponte levou o receptor a uma estrutura mais aberta, favorecendo a ligação da [Sar 1 ]-AngII que interage diretamente com a alça EC-3, do que com a AngII que interage inicialmente com a região N-terminal para depois interagir com a alça EC-3. Entretanto no caso da 125 I-AngII cuja ligação com o receptor AT1 selvagem foi normal mas foi impedida pela mutação C18S, pode estar relacionada com um modo de interação diferente apresentado pela 125 I-AngII devido a iodação no seu resíduo Tyr 4 . Com relação à alta expressão do receptor mutado na região Peri-nuclear do que na membrana plasmática, a observação que o tratamento das células com os antagonistas do receptor AT1 alterou a expressão funcional, demonstrada pela reversão na produção de IP3 e na regulação de [Ca2+]i, reforçou a hipótese da internalização constitutiva. Essa conclusão foi corroborada pela falta de co-localização do receptor ligado ao GFP a calnexina, indicando que o receptor não sofreu falta de maturação, uma das hipóteses que explicaria a maior presença intracelular do mutante. Portanto a internalização do receptor parece ser a causa mais provável para a predominância do receptor na região Peri-nuclear e essa internalização constitutiva pode estar associada à mudança na estrutura do receptor AT1 que passou a assumir aquela mais parecida com a forma ativada do receptor mesmo na ausência do ligante

ASSUNTO(S)

receptores mutante angiotensina ii sinalização trifosfato de inositol cálcio intracelular fluorescência polarizada biologia molecular

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