Genetic transformation of soybean cotyledonary node seeking the cosuppression of the lysophosphatidycholine acyltransferase / Transformação genética de nós cotiledonares de soja visando à co-supressão do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

A soja (Glycine max L. Merrill) é uma das mais importantes culturas do mundo e a maior do Brasil em área plantada. O Brasil é o segundo maior produtor mundial desta leguminosa atingindo 56,3 milhões de toneladas na safra 2006/2007. (www.conab.gov.br). Assim, modificações usando técnicas de engenharia genética podem facilitar o rápido desenvolvimento de novas variedades com características de interesse agronômico e industrial. Alterações nas proporções relativas dos ácidos graxos na fração óleo podem ser alcançadas por meio do silenciamento gênico de enzimas do tipo aciltransferases, fosfotransferases e dessaturases, envolvidas na biossíntese de ácidos graxos. Os objetivos deste trabalho foram: isolar um fragmento do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase (LPCAT) de soja, construir um cassete de expressão, contendo este fragmento, sob o controle da região promotora do gene da subunidade α da β-conglicinina (promotor semente-específico) e transformar nós cotiledonares de soja com esta construção, visando à co-supressão do gene LPCAT. A análise por RT-PCR mostrou que o gene LPCAT é expresso em todos os estádios de desenvolvimento da semente. O cassete de aproximadamente 800 pb contendo a seqüência do promotor semente-específico e de parte do gene LPCAT foi clonado no vetor binário pCAMBIA 1304, cujo T-DNA apresenta genes para resistência aos antibióticos canamicina, para seleção em bactérias, e Higromicina B para seleção em plantas. A clonagem foi confirmada por meio de PCR, restrição enzimática e seqüenciamento. A construção clonada no vetor pCAMBIA 1304 foi utilizada para a transformação de soja via Agrobacterium tumefaciens e sonicação. Sementes maduras de soja foram desinfetadas e germinadas em meio B5 durante, aproximadamente, 5 dias. A partir de uma semente, dois explantes foram obtidos, primeiramente removendo-se a raiz, em seguida, a maior parte do hipocótilo e finalmente um corte vertical feito para separar os dois cotilédones. Estes explantes foram transformados com suspensão bacteriana mediante sonicação e adição de acetoseringona. Após 3 dias de co-cultivo, os nós-cotiledonares foram transferidos para meio de indução (SIM) sem agente seletivo, durante 14 dias. Em seguida, foi adicionado ao meio SIM 5mg/L de Higromicina B para seleção dos transformantes. Os explantes que sobreviveram a essa seleção foram transferidos para o meio de elongação (SEM), ainda com Higromicina B, e depois para o meio de enraizamento (RM) sem o agente seletivo. Dois meses após inoculação com A. tumefaciens, múltiplos brotos foram produzidos nas regiões nodais resistentes a Higromicina B que estavam em contato direto com o meio. Análises a partir do DNA de folhas de plantas em fase de aclimatação permitiram a detecção de vários eventos de transformação. Dezessete eventos foram confirmados por reações de PCR com primers específicos para seqüências presentes apenas em plantas transformadas.

ASSUNTO(S)

biosynthesis transformação genética vegetal Ácidos graxos genetica molecular e de microorganismos fatty acids genetic transformation of plants agrobacterium tumefaciens biossíntese agrobacterium tumefaciens

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