Functional expression and characterization of the serina protease of the virus of the affection / Expressão funcional e caracterização da serina protease do vírus da dengue

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

Dengue (DEN) hoje é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos (arbovirose) nos países tropicais e subtropicais atingindo pelo menos 100 milhões de indivíduos a cada ano. A doença é causada por qualquer um dos quatro sorotipos do vírus da dengue (DEN-1, -2, -3 e 4), membros da família Flaviviridae, gênero Flavivírus. Ainda não existe disponível uma vacina ou drogas antivirais específicas para o controle da infecção por DEN. O vírus da DEN possui uma serina protease, codificada pelos 185 primeiros aminoácidos da região N-terminal da proteína não-estrutural 3 (NS3pro). Esta enzima é responsável pelas clivagens em cis e em trans da poliproteína, gerando as proteínas virais que são essenciais para a replicação e maturação dos virions. A inibição deste processo poderia impedir a replicação viral, o que torna a protease um atrativo alvo para o desenvolvimento de drogas. A NS3pro requer a interação com um cofator, o core de 40 aminoácidos da proteína não-estrutural 2B (NS2B), para ser ativada. Uma droga que competisse pelo sítio ativo da protease também poderia ser uma alternativa para o bloqueio da infecção viral. Levando em conta o sucesso obtido com os inibidores de protease do HIV e de HCV decidimos investir na expressão funcional do complexo da serina protease dos vírus da dengue (DEN1 e DEN2), formado pela co-expressão do cofator e da a protease. Obtivemos sucesso na expressão funcional da serina protease de DEN2, que apresentou atividade quando testada em substratos quimicamente sintetizados e com parâmetros de cinética de hidrólise semelhantes aos obtidos com uma outra serina protease de DEN2 (cepa NGC) já bem caracterizada. Atualmente estamos caracterizando funcionalmente a enzima de DEN1. A obtenção de complexos da protease funcionalmente ativos é fundamental para estudos visando a determinação da estrutura tridimensional da enzima na presença de diferentes inibidores, potenciais candidatos a drogas antivirais. Somado a isto, construímos diversos complexos da protease quiméricos (cofatorDEN1/proteaseDEN2, cofatorDEN2/proteaseDEN1 e cofatorFA/proteaseDEN2), a fim de estudarmos a especificidade do cofator em relação a interação com a NS3pro de diferentes sorotipos ou outros flavivirus. Testes funcionais, utilizando peptídeos sintéticos correspondentes as regiões de clivagem da poliproteína viral foram realizados. A proteína quimérica DEN1co/DEN2pro apresentou atividade nos ensaios realizados, clivando os substratos em cis e em trans da poliproteína viral de DEN1. A partir desses dados é possível especular que o cofator possa servir de alvo para o desenvolvimento de uma droga capaz de interferir no mecanismo de ação, isto é na interação com a NS3. Estamos atualmente testando as outras quimeras com diferentes substratos e esperamos que os dados dos ensaios funcionais possam validar nossa hipótese em breve. Como perspectiva a curto prazo, os complexos da protease ativos serão utilizadas para estudos de cristalografia.

ASSUNTO(S)

serina endopeptidases biofisica celular dengue dengue endopeptidases serina

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