Filogeny and filogeografy of porcine circovirus 2 (PCV2), construction and characterization of a recombinant adenovirus that express capsid protein of PCV2 / Filogenia e filogeografia do porcine circovirus 2 (PCV2), construção e caracterização de um adenovírus recombinante que expressa a proteína do capsídeo do PCV2

AUTOR(ES)

Orlando Chiarelli Neto

DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

O circovirus suíno 2 (PCV2) é o principal agente causador da síndrome da postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) e está associado a diferentes síndromes em suínos. O genoma do PCV2 possui três ORFs principais, sendo a ORF2 a codificadora da proteína do capsídeo. No primeiro estudo, sequências de nucleotídeos da ORF2 de 30 isolados brasileiros foram analizadas e comparadas com outras sequências depositadas no GenBank usando uma abordagem filogenética e filogeográfica. No segundo estudo, a fim de controlar a circovirose suína, nós construímos um sistema de expressão gênica da ORF2 do PCV2 em vetor adenovírus. Primeiramente, um total de onze amostras de seis estados brasileiros foram coletadas e as ORF2 foram clonadas em vetor pGEM T-easy e sequenciadas. Nossos resultados, portanto, mostraram uma alta variabilidade de sequências no Brasil além de os isolados brasileiros serem classificados nos subgrupos 1AB, 2D e 2, e que o vírus foi introduzido no Brasil mais que uma vez. Em seguida, a ORF2 de um desses isolados foi amplificada pela reação da polimerase em cadeia (PCR) e clonada em vetor pGEM T-easy. Células de Escherichia coli DH5α foram transformadas com o plasmídeo recombinante (pGEM-ORF2) e o material genético amplificado. A clonagem foi confirmada por sequenciamento e ensaio de restrição com a enzima EcoRI. Confirmada a clonagem, o plasmídeo foi clivado pelas enzimas AclI e NheI, liberando a ORF2. Este segmento foi clonado no vetor pAD5-Blue previamente clivado pelas enzimas ClaI e XbaI. Células de E. coli TOP10 foram transformadas com a construção (pAd5-Blue ORF2); as colônias recombinantes foram selecionadas e o material genético multiplicado. Este plasmídeo foi linearizado pela enzima PacI e trasnfectado em células da linhagem HEK 293. A expressão viral in vitro foi confirmada por imunoperoxidase em monocamada, Western blotting e imunofluorescência. Os vírus purificados foram titulados em 2 x108 TCID50/50μL. Duas doses de vírus purificado foram inoculadas em camundongos BALB/c para verificação da resposta imune. Soro e baço dos animais foram coletados para ensaios de resposta humoral e celular, respectivamente. A resposta imune celular se caracterizou por uma eficiente expressão de mRNA de INF-γ bem como a proliferação de linfócitos T CD8+. Em relação à resposta humoral, o candidato vacinal apresentou produção de anticorpos principalmente após a segunda dose evidenciado na coleta de soro do dia 45. De acordo com os resultados encontrados neste trabalho, acredita-se que este modelo de vacina possa ser utilizado em suíno SPF e convercional uma vez que em modelo murino, o adenovírus recombinante foi capaz de estimular resposta imune celular, em especial linfócitos T CD8+, o que destaca eficiênica na eliminação do PCV2.

ASSUNTO(S)

adenovírus pvc2 biologia molecular adenovirus pvc2 filogeografia filogeography

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