Farmacologia do Receptor do Hormônio Tiroidiano, Nova mutação no sítio de "splicing" do gene do hormônio luteinizante e Determinação da atividade da Luciferase : um novo método para medida in vitro de interação proteína-proteína

AUTOR(ES)

Gustavo Barcelos Barra

DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

Os hormônios tireoideanos (HTs) são necessários para a diferenciação, crescimento e metabolismo de diversos tecidos de mamíferos. Seus efeitos são mediados pelos receptores do hormônio tireoideano (TRs), que pertencem à superfamília dos receptores nucleares. Os TRs são fatores de transcrição que se ligam ao DNA nos promotores dos genes alvos, em regiões denominadas de elementos responsivos ao TR (TRE). Para modular a atividade transcricional (repressão ou ativação) TR se interage com correpressores e co-ativadores, na ausência e na presença de T3, respectivamente. Para melhor se entender a relação entre estrutura e função do TR, investigamos o papel da isoleucina 280 na interação deste com o correpressor SMRT e com os coativadores SRC1 e GRIP. Para isso utilizamos TRs mutantes onde a isoleucina 280 foi substituída por uma arginina (I280R), metionina (I280M), ou lisina (I280K). A atividade transcricional destes mutantes foi avaliada nos elementos responsivos positivos (DR4, F2, e TREpal) por ensaio de gene repórter luciferase e a interação com os correguladores pelo ensaio de interação proteína-proteína em solução (GST pull down). Além disso, utilizamos o mutante F451X, descrito na síndrome de resistência ao HT, pois esse receptor se interage avidamente aos correpressores. Nossos resultados demonstraram que os mutantes I280K e I280R foram transcricionalmente inativos em DR4, F2 e TREpal. Por outro lado, quando comparado ao TR 1 selvagem, a mutação I280M não modificou a atividade transcricional em DR4, F2 e TREpal. Adicionalmente, a diferença observada nas capacidades transcricionais de I280M, I280R, e I280K em DR4, F2 e TREpal correlacionou-se com a capacidade de se interagir com os coativadores, pois, apenas o mutante I280M foi capaz de se ligar ao GRIP e ao SRC1 de forma semelhante ao TR selvagem. Além disso, I280M, I280K e I280R apresentaram uma diminuição na capacidade de se interagir o correpressor SMRT e a introdução da mutação I280R no F451X aboliu a alta capacidade de ligação deste mutante ao correpressores. Para completa compreensão das diferenças entre I280M, I280R, e I280K testamos a 125 . Observamos que a mutação I280M capacidade de ligação ao T3 pelo ensaio de ligação ao T3-I reduz discretamente a afinidade do T3 ao TR 1, enquanto que as mutações I280R e I280K abole a ligação do T3 ao TR 1. Assim, I280R e I280K além de impedir a ligação os correpressores impedem também à ligação ao hormônio, o que não ocorre com o I280M. Por outro lado, I280M, I280R e I280K se heterodimerizaram com RXR de forma semelhante ao TR selvagem. Diante dessas observações, para melhor compreensão do mecanismo molecular envolvido na repressão mediada por T3, avaliamos a atividade transcricional dos mutantes I280R, I280M, I280K, F451X e I280R/F451X sobre alguns promotores regulados negativamente como: Colagenase-1, Hormônio liberador de tirotropina (TRH) e Superóxido dismutase 1 (SOD-1). A soma dos nossos achados demonstra que, de forma geral, nesses promotores, na ausência de T3, TR estimula a transcrição e que essa ativação é de alguma forma dependente da interação com os correpressores. Por outro lado, a repressão da transcrição mediada por T3, depende da manutenção da superfície de interação com os coativadores. Em conclusão, as diferenças nos resultados observados em nossos mutantes parece ser secundária às diferenças existentes entre as cadeias laterais dos aminoácidos isoleucina, arginina, lisina e metionina (Isoleucina e metionina possuem cadeia lateral hidrofóbica, arginina e lisina possuem cadeias laterais polares e carregadas positivamente). O resíduo I280 está localizado na superfície de ligação ao correpressor, não faz contato direto com o co-ativador, em outros receptores nucleares seu correspondente é sempre de resíduos hidrofóbicos (isoleucina, Leucina, Valina, Metionina) e aparentemente tem a função de interagir com aminoácidos da face interna da H12. Dessa forma, as cadeias laterais carregadas positivamente pelos aminoácidos lisina e arginina poderiam impedir a sustentação da H12 em sua posição correta o que, conseqüentemente, impedir a formação da superfície de ligação aos co-ativadores e também diminuir a afinidade pelo ligante. Além disso, nos promotores regulados negativamente, na ausência de T3, a ativação da transcrição por TR depende da manutenção da superfície de interação com correpressores, enquanto que a repressão da transcrição mediada por T3 exige a preservação da interface de interação do TR com os coativadores.

ASSUNTO(S)

ensaio de luciferase receptor do hormônio tiroidiano ciencias da saude hormônio luteinizante

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