Estudos estruturais e bioquímicos das septinas humanas bradeiona alfa e beta: moléculas relacionadas com o desenvolvimento de câncer do cólon, reto e melanoma maligno / Human SETPT4: heterologoes expression, Purification and biophysical characterization
AUTOR(ES)
Wânius José Garcia da Silva
DATA DE PUBLICAÇÃO
2005
RESUMO
Septinas constituem uma família de proteínas de ligação a GTP que foram inicialmente identificadas em levedura Saccharomyces cerevisiae, mas também estão presentes em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de leveduras, Drosophila e cérebros de mamíferos na forma de filamentos, porém o mecanismo através do qual acorre a formação destes filamentos ainda não é muito bem compreendido. Septinas são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. O gene SEPT4 foi identificado por M. Tanaka e colaboradores a partir do cDNA de cérebro humano e apresentou duas distintas transcrições: Bradeiona ? e ?. Interessantemente, além de cérebro e coração, as proteínas Bradeiona Α e Β. são detectadas somente em câncer do cólon, reto, próstata e melanoma maligno. Neste trabalho, o gene da proteína Bradeiona Β foi subclonado em um vetor de expressão bacteriano, produzido em E. coli e purificado com sucesso. O espectro de dicroísmo circular (CD) mostrou o perfil característico de proteínas com hélices a na estrutura secundária. Resultados de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS) indicam que a septina Bradeina foi produzida na forma de um estável oligômero com características monodispersivas, que foi subseqüentemente cristalizado em PEG6000. A atividade GTPase da Bradeiona Β foi comprovada através da técnica de eletroforese capilar (CE), mostrando-se absolutamente dependente de íons Mg2+. Inibição da atividade GTPase foi verificada em altas concentrações de Mg2+ (maiores que 5 mM). Com a finalidade de caracterizar os domínios preditos da Bradeiona Β (Fragmento Conservado e domínio GTPase), essas regiões foram previamente definidas, expressas em E. cozi e purificadas com sucesso. Resultados de CD, SEC, espectroscopia de fluorescência e NMR-600MHz indicam que o FC foi produzido na forma de um estável monômero com pouca estrutura secundária regular. Resultados de DLS e CD indicam que a fusão 6xHis-DGTPase foi produzida na forma de um oligômero com a presença de hélices a na estrutura secundária. A fusão 6xHis-DGTPase mostrou-se instável a altas concentrações na ausência de imidazol. A atividade GTPase da fusão GST+DGTPase foi comprovada, similarmente a Bradeiona , através da técnica de CE. Novamente, verificou-se dependência de íons Mg2+ (para a atividade catalítica) e inibição em altas concentrações de Mg2+. A fusão GST+DGTPase também foi capaz de hidrolisar ATP. Espera-se que as informações relatadas neste estudo proporcionem um alicerce para estudos estruturais/funcionais futuros das proteínas Bradeiona Α e Βoutras septinas.
ASSUNTO(S)
hetero-filamentos domínio gtpase neurodegenerative disorders câncer colo-retal mal de alzheimer alzheimer´s disease doenças neurodegenerativas gtpase heterofilaments human colorectal cancer septin septin interação com membrana membrane interactions
