Estudos da Proteína Similar à Esfingomielinase-D Encontrada na Biblioteca de cDNA da Glândula da Seda de Nephilengys cruentata

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

A possibilidade de expressão de proteínas constituintes das sedas de aranhas em larga escala com a cinética desejada usando sistemas heterólogos, pode permitir sua aplicação em vários produtos médicos como curativos e microfilamentos de suturas para neurocirurgias. Neste contexto, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula da seda da aranha Nephilengys cruentata, onde foram encontrados, além dos genes estruturais da seda, outros ainda não descritos. Dentre estes, a predição da estrutura primária da seqüência codificante do clone H09, denominada proteína H09, apresentou identidade com uma esfingomielinase-D, principal responsável pelo loxoscelismo, condição clinica produzida por venenos provenientes de aranhas do gênero Loxosceles sp. O objetivo deste trabalho foi o estudo comparativo, filogenético e da expressão da seqüência codificante referente ao clone H09. A transcrição do mRNA correspondente ao clone H09 foi confirmada por meio de Northern Blot e RT-PCR havendo hibridização e amplificação somente para transcritos da glândula da seda de Nephilengys cruentata. De acordo com a análise filogenética, a proteína H09 apresentou um nível de similaridade de 29 a 35% com dez esfingomielinases descritas em Loxosceles sp. Utilizando análise tridimencional comparativa com o mesmo grupo de esfingomielinases e algumas defensinas do banco de dados Swiss-Prot, foi feita a predição da função da proteína H09, que se posicionou entre ambos os grupos indicando uma possível função de defesa. Para obtenção de grande quantidade de proteína H09, a seqüência codificante foi clonada no vetor de expressão pET21a e utilizadas três cepas de E. coli, Origami, PLYSs, que é própria para expressão de gene tóxicos e PRIL que possui copias adicionais de codons raros em E. coli. Estas linhagens foram transformadas na tentativa de expressar a proteína recombinante. Diversos parâmetros como tempo de indução, concentração de IPTG, temperatura de incubação, rotação e meio de cultura foram também testados na otimização do protocolo de expressão. Em nenhuma das condições avaliadas foi detectada a produção de H09 por meio de Western Blot.

ASSUNTO(S)

esfingomielinase nephilengys cruentata biologia molecular biblioteca de cdna cdna library nephilengys cruentata sphingomyelinase

ACESSO AO ARTIGO

Documentos Relacionados