Conidial anastomosis tubes function in the genetic recombination in Colletotrichum lindemuthianum / A funÃÃo das anastomoses entre conÃdios na recombinaÃÃo genÃtica em Colletotrichum lindemuthianum

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

O Colletotrichum lindemuthianum, agente causal da antracnose do feijoeiro, apresenta ampla variabilidade patogÃnica e genÃtica, o que tem dificultado o desenvolvimento de cultivares resistentes. VÃrios sÃo os mecanismos responsÃveis pela recombinaÃÃo genÃtica em fungos filamentosos. Este trabalho foi realizado com os objetivos de otimizar o protocolo para a obtenÃÃo e a regeneraÃÃo de protoplastos, visando à manipulaÃÃo genÃtica; estudar a biologia dos tubos de anastomoses entre conÃdios (CATs) em C. lindemuthianum para anÃlise in vivo e obter transformantes com nÃcleo marcado com proteÃnas fluorescentes, visando comprovar a ocorrÃncia de recombinaÃÃo genÃtica na ausÃncia do ciclo sexual utilizando imagens de cÃlulas in vivo. Primeiramente, com o objetivo de transformar as diferentes raÃas de C. lindemuthianum para a marcaÃÃo do nÃcleo com proteÃnas fluorescentes verde e vermelha (GFP e tdimerRed, respectivamente), foi realizado um trabalho de otimizaÃÃo nas condiÃÃes de obtenÃÃo e regeneraÃÃo de protoplastos desta espÃcie. Para a formaÃÃo de protoplastos, foram testados diferentes tipos e concentraÃÃes de estabilizadores osmÃticos, tempo de incubaÃÃo, idade micelial e concentraÃÃo de enzima de lise. Depois de otimizadas as condiÃÃes para a obtenÃÃo dos protoplastos, foram testados diferentes estabilizadores osmÃticos para a regeneraÃÃo. As melhores condiÃÃes para a obtenÃÃo de protoplastos do isolado de C. lindemuthianum foram obtidas utilizando-se micÃlio com 48 horas, em estabilizador osmÃtico NaCl 0,6 M, 30 mg.mL-1 da enzima Lysing Enzymes e tempo de digestÃo de 3 horas. Sacarose 1,2M e 1M foi o estabilizador mais apropriado para a regeneraÃÃo. Utilizando esta metodologia foram realizadas as transformaÃÃes com os plasmÃdeos pMF357, que possui o gene da histona H1 ligada a GFP e o gene de resistÃncia à higromicina e pGR02, que possui o gene de histona H4 em fusÃo com tdimerRed (vermelho) e o gene de resistÃncia à fleomicina. Posteriormente, os aspectos relacionados à formaÃÃo e à ocorrÃncia de CATs foram estudados, utilizando-se quatro isolados de C. lindemuthianum, sendo dois pertencentes à raÃa 65 e um de cada uma das raÃas 73 e 81. Foram testados diferentes meios de cultivo, idade da cultura e tempo de incubaÃÃo, demonstrando a necessidade de condiÃÃes adversas à germinaÃÃo para a fusÃo de CATs. Dessa forma, foi possÃvel desenvolver uma metodologia fÃcil e prÃtica para o estudo de CATs em in vivo e que facilitarà estudos da funÃÃo biolÃgica dessas cÃlulas em um fitopatÃgeno. Experimentos de compatibilidade vegetativa foram realizados, indicando a incompatibilidade do heterocÃrio na colÃnia madura entre as raÃas transformadas 65b (verde) e 73 (vermelho). A incompatibilidade foi comprovada por meio da morte celular apÃs a fusÃo de hifas. No entanto, foi possÃvel visualizar a formaÃÃo do heterocÃrio e a passagem de nÃcleo entre esses isolados vegetativamente incompatÃveis, por meio da fusÃo de CATs. A recombinaÃÃo entre os isolados pode ser comprovada utilizando-se os marcadores para resistÃncia aos antibiÃticos higromicina e fleomicina, alÃm de primers especÃficos para os genes de interesse. Portanto, este mecanismo de fusÃo de CATs à uma fonte potencial de recombinaÃÃo genÃtica e/ou surgimento de novas raÃas e pode explicar a ocorrÃncia da transferÃncia horizontal de genes dentro dessa espÃcie entre isolados incompatÃveis ou, mesmo, entre diferentes espÃcies, levando ao surgimento de patÃgenos mais virulentos.

ASSUNTO(S)

genetics of microrganisms proteÃnas fluorescentes confocal colletotrichum lindemuthianum confocal anthracnose antracnose recombinaÃÃo assexual asexual recombination fluorescent proteins colletotrichum lindemuthianum conidial anastomosis tubes genÃtica de microorganismos conidial anastomosis tubes genetica vegetal

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