Comparação de quatro métodos de PCR para o diagnóstico da leishmaniose viceral canina em amostras coletadas por Swab conjuntival / Comparison of four PCR methods for diagnosis o canine visceral leishmaniasis in samples collected by the conjuctival swab procedure

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

Muitos estudos já demonstraram a aplicabilidade da reação em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC), cujo agente etiológico no Brasil é a Leishmania (Leishmania) chagasi. Um dos maiores obstáculos para a implementação desta técnica é a falta de padronização. Centenas de trabalhos foram publicados até o momento sobre o diagnóstico por PCR das leishmanioses, mas poucos foram realizados com a finalidade de comparar a eficiência dos diversos protocolos disponíveis. O objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade de quatro métodos de PCR para o diagnóstico da LVC. As técnicas foram primeiramente testadas usando DNA purificado de promastigotas cultivados e em seguida em amostras coletadas de cães infectados pelo método do swab conjuntival. Todos os métodos de PCR utilizados neste trabalho apresentam duas etapas: amplificação seguida de hibridização ou de uma nova amplificação (nested ou semi nested). Dois dos métodos (kDNA PCR-Hibridização e kDNA snPCR) utilizam iniciadores endereçados aos minicírculos do cinetoplasto (kDNA) e os outros dois métodos apresentam como alvo a região codificante (LnPCR) e intergênica não codificante (ITS1 nPCR) dos genes do RNA ribossômico (RNAr). Quando foi utilizado DNA purificado de L. (L.) chagasi o kDNA snPCR apresentou a melhor sensibilidade detectando até 10 fg enquanto que os outros métodos detectaram até 100 fg. Estes resultados não se correlacionaram bem com os obtidos de cães infectados através do swab conjuntival. Dois grupos de 23 cães foram usados. No Grupo 1 o DNA foi extraído dos swabs pelo método do fenol-clorofórmio e no Grupo 2 por fervura. Para os cães do grupo 1 os métodos mais eficientes foram os baseados em alvos de kDNA. O kDNA PCR-Hibridização detectou parasitas em 22/23 cães (95,6%) e em 40/46 amostras (86,9%), considerando as conjuntivas direita e esquerda. O kDNA snPCR foi positivo para 21/23 cães (91,3%) e para 40/46 amostras (86,9%). As positividades destes métodos foram significativamente superiores as obtidas pelos métodos com alvos nos genes de RNAr (p<0,05). O método LnPCR obteve resultado positivo em 17/23 cães (73,9%) e em 30/46 amostras (65.2%). Já o ITS1 nPCR conseguiu detectar os parasitas em 16/23 cães (69,6%) e 28/46 (60,9%) das amostras. No grupo 2 o método kDNA PCR-Hibridização também mostrou melhor desempenho detectando parasitas em 18/23 cães (78,3%) e em 31/46 amostras (67,4%), resultado significativamente superior (p<0.05) aos outros três métodos. As positividades dos métodos kDNA snPCR e LnPCR foram abaixo do esperado e estes ensaios parecem ter sofrido algum tipo de inibição relacionada ao processo de extração de DNA. A maior sensibilidade dos métodos baseados em minicírculos de kDNA descrita por outros pesquisadores foi confirmada neste estudo. O kDNA PCR-Hibridização mostrou a melhor sensibilidade entre os métodos avaliados, entretanto a escolha do melhor método vai depender do tipo de informação requerida com o diagnóstico. Como um todo, nossos resultados apóiam a aplicabilidade do método do swab conjuntival para diagnóstico da LVC.

ASSUNTO(S)

diagnosticos cães hybridization polymerase chain reaction doenças infecciosas reação em cadeia da polimerase diagnosis infection diseases leishmaniose visceral hibridização leishmaniasis dogs parasitologia

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