Caracterização parcial da toxina citoletal distensora (CLTD) de escherichia coli

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

1997

RESUMO

Neste trabalho foram pesquisadas as melhores condições de cultivo e estocagem da amostra de Escherichia coli 86-6136 para a produção da Toxina Citoletal Distensora (CLDT), assim como o melhor método de extração e purificação para a caracterização parcial da toxina. Após o que, foi realizada a produção de anticorpos neutralizantes policlonais em coelhos albinos e a análise dos efeitos citopáticos e citotóxicos da CLDT em cultura de células. O melhor meio para cultivo da amostra 86-6136 encontrado foi o "Evans Toxin Medium", pois com este meio foi verificada a produção de CLDT em ensaios de atividade citotóxica em cultura de células, com efeito semelhante ao descrito em literatura. Os estudos de obtenção da toxina demonstraram que o método mais vantajoso para a extração era a ultrasonicação do sedimento bacteriano, pois dispendia menos tempo e havia boa recuperação da atividade citotóxica, quando comparado com os outros métodos empregados, além de existir ganho no rendimento de mais de 4 vezes em atividade específica e 2 vezes em citotoxicidade, quando comparado ao sobrenadante inicial. Após a extração, o material foi submetido a diversos processos cromatográficos (Deae-Sepharose Fast-Flow; CM-Sepharose Fast-Flow; Phenil Sepharose; Sepharose CL6B; Sepharose CL4B; Superdex 200). A cromatografia que teve mais relevância para melhorar o grau de pureza da amostra foi em Sepharose CL6B. A amostra, quando submetida a cromatografia nesta resina, mostrou padrão de eluição com 3 picos, sendo que a atividade biológica estava concentrada no primeiro pico. Em eletroforese com SDS-P AGE, o material contendo atividade biológica apresentou 3 bandas, com os pesos moleculares estimados em 38,8; 37,3 e 22,4 kDa. Não foram obtidos resultados em ensaios eletroforéticos em P AGE convencional. Os ensaios cromatográficos em Sepharose CL6B resultaram em aumento de 100 vezes na citotoxicidade da amostra, e 237 vezes em atividade relativa. Os ensaios em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em coluna Mono-Q não permitiram a recuperação da atividade citotóxica da toxina CLDT, e por isso foram abandonados. A atividade da toxina CLDT pôde ser observada em cultura de células Vero, HeLa e CHO. Apenas nas células CHO tanto o efeito citopático quanto o citotóxico foram observados. Em ensaios em células Vero e HeLa, o efeito de distensão celular não é evidente, e em células Vero, a viabilidade celular, ao final das 120 hrs de ensaio, é bem maior em relação às outras duas linhagens. A produção de anticorpo policlonal em coelhos albinos pôde ser verificada em teste de imunodifusão radial dupla, e sua capacidade neutralizante foi observada em ensaios de soroneutralização em cultura de células CHO. Os antissoros obtidos apresentaram atividade neutralizante do efeito citotóxico da toxina CLDT no título até 1/1024

ASSUNTO(S)

escherichia coli toxinas

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