Caracterização funcional da proteína SmRbx: um aproteína de Schistosoma mansoni similar à proteína RING box envolvida no processo de Ubiquitinação

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

A ubiquitinação é parte do processo que leva à proteólise, onde a proteína poliubiquitinada é direcionada para a degradação pelo proteassomo 26S. A transferência da ubiquitina para a proteína alvo é feita por uma enzima ligase E3. Um dos membros da classe E3 é o complexo SCF. Este complexo é composto pelas proteínas Cul1, Skp1, um membro da família F-box e um membro da família RING box. Em humanos, esta última é denominada Rbx1 e seu homólogo em leveduras HRT1. Foi verificado que a proteína humana é capaz de complementar a letalidade de HRT1 em leveduras nocaute para este gene, desempenhando ambas a mesma função bioquímica. Isolamos em nosso laboratório o cDNA codificador da proteína SmRbx, o homólogo de Schistosoma mansoni a Rbx1 e HRT1. Estudos in silico, demonstraram que SmRbx está presente como única cópia no genoma de S. mansoni, possui três íntrons e o transcrito está presente em estágios do ciclo de vida do parasito em ambos os hospedeiros. Para verificar se SmRbx está envolvida no processo de ubiquitinação, foi feito um estudo de complementação funcional heteróloga em leveduras. Para a obtenção de uma linhagem de levedura nocaute para o gene codificador da proteína HRT1, leveduras Saccharomyces cerevisiae diplóides foram utilizadas para a disrupção de um dos alelos do gene de interesse. A necessidade do uso de leveduras diplóides é devido ao fato do nocaute haplóide de HRT1 ser letal. A disrupção do gene HRT1 de leveduras diplóides foi feita por recombinação homóloga, introduzindo-se o gene HIS3 no interior da região ativadora de HRT1. Leveduras diplóides nocaute para um alelo de HRT1 e contendo o cDNA de SmRbx, clonado em plasmídio, foram esporuladas. Através de micromanipulação foram obtidas leveduras haplóides. A complementação funcional foi confirmada pela restituição do crescimento de leveduras haplóides nocaute para HRT1, contendo o cDNA de SmRbx. Foi verificado que leveduras nocaute contendo o gene de S. mansoni apresentam uma morfologia alongada e não foram capazes de crescer nas temperaturas de 23°C e 37°C, mas possuíam um crescimento normal a 30°C, quando comparadas com a levedura selvagem. Estes resultados indicam que a complementação com o gene do parasito não é perfeita. Para identificar regiões da proteína SmRbx essenciais para sua função, mutantes do gene foram produzidos por várias deleções nas regiões codificadoras das porções N-terminal e C-terminal da proteína por PCR. Regiões envolvidas na interação com culina são essenciais para a função da proteína, pois mutantes perdendo os primeiros 24 resíduos de aminoácidos da região N-terminal e outro sem 18 resíduos da região C-terminal não eram mais capazes de complementar a cepa de levedura deletada em HRT1. A interação de SmRbx e culina de leveduras foi testada pelo sistema do duplo-híbrido. Para esse ensaio, foi utilizada a porção da proteína Cul1 de S. cerevisiae que interage com Rbx1 humana e SmRbx completa ou SmRbx24 (deletada de 24 resíduos N-terminal). Leveduras onde foi detectada a ativação dos genes repórteres HIS3 e -galactosidase demonstraram que SmRbx, mas não SmRbx24, é capaz de interagir com Cul1. Estes resultados sugerem que a proteína SmRbx provavelmente está envolvida no processo de ubiquitinação, assim como suas ortólogas em humanos e leveduras. A proteína recombinante foi produzida em sistema bacteriano e utilizada para imunizar camundongos BALB/c, mas após a quinta imunização, o soro dos camundongos não apresentou anticorpos policlonais anti-SmRbx, indicando que a alta similaridade entre a proteína de S. mansoni e sua contraparte murina provavelmente impossibilitou a produção de anticorpos.

ASSUNTO(S)

schistosoma mansoni teses. ubiquitinação decs bioquímica teses. 

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