AvaliaÃÃo bioquimica da diversidade genÃtica de linhagens de Chromobacterium violaceum e caracterizaÃÃo molecular do gene de quitinase

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, pigmentada, aerÃbica facultativa, que vive em regiÃes de climas tropicais e subtropicais, encontrada principalmente, em solos e rios. Seu potencial biotecnolÃgico demonstrado foi atravÃs do genoma seqÃenciado da C. violaceum ATCC 12472, que apresentou genes desconhecidos relacionados à biossÃntese de quitina. Neste trabalho foi avaliada inicialmente a diversidade genÃtica de quatorze linhagens de C. violaceum de diferentes procedÃncias, utilizando mÃtodos bioquÃmicos e moleculares, das quais duas foram selecionadas para anÃlise do sistema quitinolÃtico. As linhagens foram crescidas no meio Luria Bertani (LB) e caracterizadas pelo perfil de Ãcidos graxos e do gene 16S rDNA, e a diversidade genÃtica, pela tÃcnica de rep-PCR. Em seguida, foi realizada a caracterizaÃÃo das linhagens de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 para a biossÃntese de quitina, utilizando cÃlulas crescidas em meio Luria Bertani (LB) com e sem a presenÃa de quitina coloidal 0,2%, sendo quantificada a atividade quitinÃsica (gel de atividade e ensaios enzimÃticos com dÃmero e trÃmero) e proteÃnas totais. As amostras foram analisadas em gel de eletroforese SDSPAGE, corados com Azul de Coomassie G-250 e os gÃis da atividade quitinÃsica foram corados com calcofluor. Para a caracterizaÃÃo do gene de quitinase foram utilizadas seqÃÃncias codificadoras de quitinase A e endoquitinase (Cv1897 e Cv2736), utilizando-se o DNA genÃmico de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 como molde na tÃcnica de PCR (ReaÃÃo em Cadeia da Polimerase), usando oligonucleotÃdeos especÃficos. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformÃtica que exploram informaÃÃes do genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulaÃÃo, domÃnios e motivos conservados. Os resultados do perfil de Ãcido graxos e 16S rDNA permitiu a caracterizaÃÃo das linhagens e o rep-PCR demonstrou que as linhagens estudadas apresentam uma diversidade genÃtica. As linhagens de C. violaceum selecionadas apresentaram um perfil diferenciado de atividade quitinolÃtica em gel desnaturante com a presenÃa de glicol quitina. Nos ensaios com os substratos sintÃticos (N,Nâ- diacetilquitobiose e N, Nâ, Nââ-triacetilquitotriose), verificou-se que houve atividade para ambos os substratos. Os resultados indicaram que os maiores valores da atividade quitinolÃtica foram observados usando-se o cromÃforo diacetilquitobiose. A seqÃÃncia codificadora do gene CV1897 (endoquitinase) apresentou 439 aminoÃcidos, correspondendo ao domÃnio quitinase (CDD:29557) da famÃlia 19 da glicosil hidrolase (257 aminoÃcidos), formada por enzimas que catalisam e hidrolisam as unidades β-1,4-N-acetil-D-glucosamina ligadas no polÃmero de quitina. AlÃm desta regiÃo, as bases restantes proporcionaram a formaÃÃo de dois sÃtios, um putativo para a construÃÃo de aÃucares e outro constituÃdo por resÃduos catalÃticos. A seqÃÃncia correspondente ao produto do gene Cv2935 sugere uma provÃvel quitinase A no genoma de C. violaceum ATCC 12472 (BrGene), sendo formada por 439 aminoÃcidos. Observou-se duas regiÃes: i) a ChtBD3 como um domÃnio obrigatÃrio para quitina tipo 3 (29..73) e CDD:47799; ii) a quitinase A com um CDD: 33272 responsÃvel pelo transporte e metabolismo de carboidratos (109..419), pertencente a famÃlia 18 da glicosil hidrolase. Os resultados obtidos caracterizaram a C. violaceum UCP 1489 com alta identidade com a linhagem ATCC 12472, demonstrando tambÃm, ambos aspectos biotecnolÃgico de produÃÃo das enzimas quitinase A (exoquitinase) da famÃlia 18 e a endoquitinase da famÃlia 19

ASSUNTO(S)

a chitinase diversidade genÃtica chromobacterium violaceum endoquitinase microbiologia endochitinase quitinase a chromobacterium violaceum. genetic diversity

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