Aspectos de alterações celulares e moleculares induzidas pela redução na produção de AHSP (Alpha hemoglobin stabilizing protein) pela interferencia de RNA em celulas K562 / Celular and molecular implications induced by AHSP knockdown in K562 cells

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

A AHSP é uma proteína que se liga à ?Hb, prevenindo a precipitação e a atividade pró-oxidante da mesma. Na presença de ?Hb, o complexo protéico ?Hb-AHSP é desmembrado e a ?Hb desloca a AHSP para formar a estrutura quartenária da hemoglobina. Em estudo com camundongos portadores de ?-talassemia com deleção do gene AHSP, foi demonstrado que estes camundongos apresentaram maior precipitação de ?Hb em seus eritrócitos e níveis acentuados de anemia. Adicionalmente, estudos in vitro, utilizando proteína recombinante, mostraram que quando as ?Hbs encontram-se estabilizadas pela AHSP, há menor produção de ROS em solução fisiológica. Desta forma, têm sido proposto que a AHSP talvez desempenhe um importante papel como modulador da gravidade clínica nas síndromes ?-talassêmicas. A relação entre a formação da hemoglobina e alterações na expressão do gene AHSP ainda é desconhecida em humanos. O estudo de tal relação molecular seria fundamental para que o papel da AHSP na eritropoese humana fosse melhor entendido, bem como embasaria futuros estudos sobre a gravidade clínica nas síndromes ?-talassêmicas em humanos. Diante disso, a relação entre a formação da hemoglobina e a diminuição da expressão do gene AHSP foi investigada neste estudo. Este trabalho teve como objetivos: induzir o silenciamento estável do gene AHSP em células humanas de linhagem eritróide, identificar possível precipitação de ?Hbs em células com redução na expressão do gene AHSP e investigar implicações no metabolismo celular decorrentes da diminuição significativa da expressão deste gene. Desta forma, células K562 foram transfectadas sem vetor, com vetor de expressão de short hairpin RNAs (shRNAs) para o gene AHSP e com vetor de expressão de shRNAs para uma seqüência de DNA controle não homóloga ao genoma humano através de eletroporação e de um reagente lipídico não lipossômico (Effectene®). Após a transfecção, as células passaram por um período de seleção com Neomicina. Terminado este período, o substrato Hemina foi acrescentado ao meio de cultura das células transfectadas e controle, para que a expressão de genes da linhagem eritróide fosse ativada. Amostras das culturas com Hemina foram coletadas e a expressão dos genes AHSP, ?-globina, ?-globina e GATA-1 foi quantificada por real-time PCR. O silenciamento do gene AHSP, em ambos os processos de transfecção, foi significativo e acima de 70%, propiciando considerável precipitação de ?Hb evidenciada por imunofluorescência, bem como acentuada diminuição na produção de hemoglobina identificada através de citometria de fluxo. Além disso, por meio desta última metodologia, evidenciou-se que as células silenciadas para AHSP tiveram maior produção de ROS e maior porcentagem de marcação celular para Anexina e PI. Adicionalmente, a análise dos dados obtidos por real-time PCR demonstrou que não houve alteração significativa na expressão dos genes ?-globina e ?-globina, e apenas GATA-1 apresentou expressão tardia significativa nas células silenciadas para AHSP. Finalmente, estes dados indicam que a expressão do AHSP está fortemente relacionada com a formação da hemoglobina e sugerem, pela primeira vez, que este gene codifica uma proteína de função crucial durante a eritropoese humana. Ainda, estes resultados reforçam a função da AHSP descrita previamente em modelos animais

ASSUNTO(S)

expressão genica rna interference hemoglobina interferencia de rna hemoglobin thalassemia talassemia gene expression

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